A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma doença clonal rara e potencialmente fatal das células estaminais hematopoiéticas, caracterizada por hemólise intravascular crónica causada pela cascata do complemento, tromboses e citopenias relacionadas com falência da medula óssea. Resulta de uma expansão mutacional de um clone que inativa o gene ligado ao cromossoma X PIG-A, causando uma deficiência de proteínas ligadas ao glicofosfatidilinositol (GPI) na superfície dos eritrócitos (RBC), monócitos e granulócitos. Estas incluem duas proteínas reguladoras do complemento na superfície dos glóbulos vermelhos, nomeadamente, CD55 (fator acelerador de decaimento – DAF) e CD59 (inibidor de lise reativa da membrana – MIRL). A deficiência nestas duas proteínas conduz à destruição dos eritrócitos in vivo [1].

Diagnóstico

O diagnóstico de HPN envolve vários testes laboratoriais:

Citometria de fluxo dos antigénios ligados ao GPI, ilustrando populações negativas de eritrócitos (RBC) e de leucócitos (WBC)
Teste de Coombs positivo
Anemia com aumento da contagem de reticulócitos
Aumento da desidrogenase lática e da bilirrubina
Diminuição da haptoglobina
Hemoglobina livre no soro e hemoglobinúria
Danos associados aos órgãos devido à hemólise e/ou trombose [1].

Imunofenotipagem por citometria de fluxo utilizando o DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit

A citometria de fluxo é considerada o método padrão para a deteção de clones de HPN, desempenhando um papel importante no diagnóstico, monitorização e gestão clínica dos doentes com HPN. A atualização mais recente das orientações de consenso da ICCS/ESCCA [resumida em 2] garante a deteção sensível e precisa de clones de HPN, incluindo os menores.

O DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit foi desenvolvido com base nesta atualização mais recente, permitindo um elevado nível de sensibilidade na deteção, em parte devido à inclusão do FLAER (proaerolizina marcada com Alexa Fluor™ 488). O FLAER liga-se aos pontos âncora do GPI, permitindo, assim, medir a sua presença ou ausência, de forma independente de qualquer marcador CD, em monócitos e granulócitos neutrófilos.

O kit fornece dois tubos por doente:

Tubo RBC, contendo CD71, CD59 e CD235a
Tubo WBC, contendo proaerolizina, CD157, CD45, CD64, CD24, CD14 e CD15

Os cocktails para cada tubo são reagentes secos, ou seja, os anticorpos estão secos na superfície do tubo. Isto permite uma maior durabilidade e armazenamento à temperatura ambiente. As Instruções de Utilização contêm mais detalhes sobre a preparação de amostras, gating e interpretação.

CASO E RESULTADOS

Uma mulher afro-americana de 19 anos apresentou-se ao serviço de urgência com tosse e urina escura; era de resto previamente saudável. O historial familiar revelou que a sua irmã fora diagnosticada com traço falciforme.

Resultados de Hematologia

Foi colhida uma amostra de sangue para o laboratório de hematologia, onde foi realizado um hemograma completo num analisador XN Series. Os resultados (Fig. 1) mostraram que a doente tinha anemia.

Rerun	Order	Run	Test	Result	C	Unit
	I	2	CBC Profile
	I	2	HGB	90		g/l
	I	2	WBC	2,56		10*9/l
	I	2	PLT	69	&	10*9/l
	I	2	RBC	2,48		10*1…
	I	2	HCT	0.277		l/l
	I	2	MCV	111,7		fl
	I	2	MCH	36,3		pg
	I	2	MCHC	325		g/l
	I	2	RDW-CV	19,9		%

			RET Profile
	R	2	RET#	70,7		10*9/l
	R	2	RET%	2,9		%
	R	2	RET-He	28,3		pg
	A	2	PLT-O	69		10*3/…

Fig. 1 Resultados laboratoriais de hematologia de um analisador XN Series.

Resumo dos parâmetros relevantes para este caso, incluindo intervalos de referência internos do hospital (entre parênteses):

Hemoglobina	90 g/l	(115 – 155 g/l)
Eritrócitos	2,48 x 10¹²/l	(3,9 – 5,6 x 10¹²/l)
Hematócrito	0,277 l/l	(0,36 – 0,48 l/l)
Contagem de reticulócitos	2,9%	(0,5 – 1,5%)

Resultados de outras análises

Outras análises laboratoriais confirmaram que a anemia era de natureza hemolítica autoimune:

Desidrogenase láctica:	3170 U/l	(87 – 225 U/l)
Bilirrubina total:	1,9 mg/dl	(0 – 1,2 mg/dl)
Bilirrubina indireta:	1,6 mg/dl	(0,2 – 0,7 mg/dl)
Teste de Coombs direto positivo

Resultados de imunofenotipagem por citometria de fluxo

A doente foi observada por um hematologista que enviou amostras para teste de HPN ao laboratório de citometria de fluxo. Foi realizada imunofenotipagem utilizando o DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit. A análise dos dados revelou um clone significativo de eritrócitos (RBC) e leucócitos (WBC) de HPN, evidenciando claramente a ausência de antigénios ligados ao GPI.

Os resultados para os eritrócitos, utilizando o tubo RBC, revelaram um clone de Tipo III de 76,75% e um clone de Tipo II de 2,54% (Fig. 2).

Fig. 2 Imunofenotipagem utilizando o tubo RBC do DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit, analisado no XF-1600

Os resultados para os leucócitos, utilizando o tubo WBC, revelaram um clone de granulócitos neutrófilos entre 95 e 97% (Fig. 3) e um clone de monócitos de 98% (Fig. 4).

Fig. 3 Imunofenotipagem utilizando o tubo WBC do DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit, analisado no XF-1600, e com gating nos granulócitos neutrófilos

Fig. 4 Imunofenotipagem utilizando o tubo WBC do DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit, analisado no XF-1600, e com gating nos monócitos

Com base nesta informação, o hematologista determinou que a doente apresentava formas homozigótica (Tipo III) e heterozigótica (Tipo II) de HPN e iniciou tratamento com eculizumab, uma terapia imunológica que se liga à proteína C5 do complemento, inibindo a ativação do sistema do complemento [3]. Esta ligação evita a destruição dos eritrócitos na corrente sanguínea.

Nos últimos seis meses, os valores de hemoglobina e contagem de eritrócitos da doente estabilizaram dentro do intervalo normal e não ocorreram mais episódios hemolíticos.

REFERÊNCIAS

[1] Cançado RD et al. (2021): Consensus statement for diagnosis and treatment of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Hematol Transfus Cell Ther; 43(3):341-348. doi: 10.1016/j.htct.2020.06.006.

[2] Illingworth AJ, Marinov I, Sutherland DR (2019): Sensitive and accurate identification of PNH clones based on ICCS/ESCCA PNH Consensus Guidelines-A summary. Int J Lab Hematol; 41 Suppl 1:73–81. doi: 10.1111/ijlh.13011. PMID: 31069981.

[3] McKeage K (2011): Eculizumab. Drugs; 71:2327–2345. https://doi.org/10.2165/11208300-000000000-00000

Citometria de fluxo clínica

Automação pensada para um novo nível de eficiência no fluxo de trabalho